水蛭素与凝血酶的亲和力极强，1ug水蛭素可(kě)中和5ug凝血酶，相应摩尔比為(wèi)1：1，即中和一个國(guó)际单位(NIH单位)的凝血酶需要一个抗凝单位(IAT—u)的水蛭素。根据以上摩尔比，以水蛭素含量為(wèi)指标，对不同浓度、温度及提取时问的水蛭提取物(wù)进行比较，选择最佳工艺路線(xiàn)，并确定水蛭提取制备工艺。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 仪器SIGMA单道移液器；RE一52A型旋转蒸发器(上海亚荣公司)；Sigma 4K15高温冷冻离心机；自动酸碱滴定仪DL53Mettler Toledo Switzer—land。

1．1．2 药物(wù)与试剂 水蛭購(gòu)于北京松兰中药饮片有(yǒu)限公司，经北京松兰中药饮片公司主任中药师蔡長(cháng)德鉴定為(wèi)水蛭科(kē)动物(wù)蚂蟥干燥全體(tǐ)；纤维蛋白原(Fibrinogen)：SIGMA；凝血酶(Thrombin)：SIGMA。

1．2 实验方法

1．2．1 水蛭素的测定方法取纤维蛋白原0.25 g，溶于50 ml的Tris—HC1缓冲液(pH-8)中，得0.5％ 的纤维蛋白原溶液。稀释凝血酶到5 NIH／ml。取0.2 ml纤维蛋白原溶液，加入20ul水蛭素提取液，并加入凝血酶至凝固，得水蛭素含量=(凝血酶浓度×凝血酶用(yòng)量)／水蛭素提取液體(tǐ)积。

1．2．2 乙醇浓度的选择称取水蛭粗粉10 g，分(fēn)别用(yòng)不同浓度的乙醇进行提取，乙醇的含量為(wèi)0%，30％ ，50％ ，70％ ，90％ ，提取温度定為(wèi)60℃ ，提取时间1.5 h，过滤，回收乙醇，样品定容為(wèi)25 ml。分(fēn)别测定样品中水蛭素含量。水蛭素的测定可(kě)依据其与凝血酶按1：1结合的原理(lǐ)，采用(yòng)以上方法测得。

1．2．3 温度条件的选择  由于水蛭素只能(néng)在80℃下稳定存在15 min，所以在选取温度时，应尽量避免温度过高造成水蛭素失活。所以本实验选用(yòng)在50OC，60OC=，70OC下分(fēn)别进行。称取水蛭粗粉10 g，采用(yòng)70％的乙醇于3个温度各提取1.5 h，并采用(yòng)同样的方法测定水蛭素含量。

1．2．4 提取时间的选择  称取水蛭粗粉10 g，用(yòng)70％ 的乙醇，在60OC下分(fēn)别提取1 h，1.5 h，2 h。分(fēn)别测定提取样品的水蛭素含量。

表1    不同浓度乙醇的提取结果

乙醇浓度(%)                         水蛭素含量(IAT-u/ml)

0                                       0.412

30                                      0.635

50                                      0.809

70                                      2.136

80                                      2.369

2．1 乙醇浓度的选择  从表1的数据可(kě)以看出，不同浓度的乙醇对水蛭的提取效果有(yǒu)较大的影响。从水蛭素的含量来看，随乙醇浓度的提高，其含量不断增加，在70％ -80％ 的乙醇浓度下，获得较好的提取效果。由于水蛭素是一种可(kě)溶于水和乙醇等有(yǒu)机溶剂的蛋白质，所以综合两种因素考虑，70％ ～80％的乙醇浓度是较好的提取浓度。

 2.2提取温度的选择  见表2

表2   不同温度的提取结果

提取温度（0C）                      水蛭素含量（IAT-u/ml）

50                                        1.881

60                                        2.105

70                                        2.156

2.3 提取时间的选择   见表3

表3 不同提取时间的提取结果

提取时间（h）                      水蛭素含量（IAT-u/ml）

1                                       1.819

1.5                                     2.130

2                                       2.165

3 小(xiǎo)结

本实验过程利用(yòng)了水蛭素和凝血酶1：1的配比关系，测定不同条件水蛭提取液的水蛭素含量，确定了水蛭工业提取的最佳条件。实验结果表明，乙醇浓度在70％ 一80％ 之间，温度在60OC左右，提取时间1.5 h会达到较好的提取效果。

金康道夫科(kē)技集团（香港）有(yǒu)限公司致力于发展集养殖、研发、生产、销售及服務(wù)為(wèi)一體(tǐ)的天然水蛭素产业链，主打产品：水蛭素、血管清道夫、天然活性多(duō)肽。金康道夫不断研发和丰富水蛭素产品線(xiàn)，以让天下人血管通畅健康長(cháng)寿為(wèi)己任，為(wèi)大众提供健康全程管理(lǐ)与服務(wù)。目前，公司产品已遠(yuǎn)销加拿(ná)大、泰國(guó)、新(xīn)加坡、马来西亚及台湾等二十多(duō)个國(guó)家和地區(qū)。